PCRって何？

新型コロナウイルス感染症の診断に使われるPCRという方法はどんな方法でしょうか。くらしとバイオプラザ21が毎年、開催している、自分のDNAを使う実験講座「私たちのDNA」の講師をしてくださっている、大藤道衛先生にPCRについて解説していただきました。

1. PCRとは、

PCR（Polymerase Chain Reaction）は、DNA断片を増やす実験技術です。日本語でもPCRと呼びます。DNAを合成する酵素（DNAポリメラーゼ）の反応を連続的に行うことで、特定の塩基配列のDNAを増やします。細胞は分裂して増えるときに、DNAポリメラーゼによりDNA量は2倍となり、分裂により各細胞に配分されます。このDNA量が2倍になる反応を、試験管内で行うのがPCRです（図１）。ここでPCRはランダムにDNAを増やすわけではありません。1本の試験管の中に2種類の「プライマー」と呼ばれる短いDNA断片(*)を加えます。その2種類のプライマーが結合（アニーリング）してとり囲んだ部分のDNA断片だけを増やし（増幅）ます（図１）。
この技術は、1983年にキャリーマリス氏（1993年ノーベル化学賞受賞）により開発され、いまでは基礎研究ばかりでなく、遺伝子検査、DNA鑑定などで用いられています。
*プライマー（約20塩基の1本鎖DNA：増幅したいDNAの一部分と相補的配列）

図1. PCR実験操作と原理　**PCR反応に適した溶液成分（増幅の図は文献1より引用）

PCR増幅のアニメーション（DNA Learning Center(Cold Spring Harbor研究所の教育教材部門制作)）

２．PCRは本当に特異的に増えるの？

実験の条件を適切に設定すれば、増やしたいDNAの断片が増やせます。

（１）

プライマーが結合する温度
まず、プライマーが結合する温度の検討です（図２）。ここで白いバンドは、ある長さのDNA断片を示しています。最初は、バンドの部分に含まれるDNA断片の塩基配列を調べて目的DNA断片が増えていることを確認します。
図2では、58℃が目的のDNA断片の増幅に最適であることがわかります。

図2. PCR条件の検討（アニーリング温度の例）　定性PCR-電気泳動解析（文献2より引用）

（２）

必要なDNA断片だけを増やすために
PCRは、適切なプライマーを設計すれば高い特異性（特異度ではない）で、千兆分の1グラム（1fg）以下のDNAを検出できる最小検出感度を持っています。しかし、PCR反応は、耐熱性酵素の種類、Mgイオン濃度、検体のDNA分解酵素、高濃度タンパク質、ヘパリン、メラニンなど様々な物質の影響を受けます。精製したDNAならば高感度に検出できますが、粗抽出の検体では増えないときもあります。実際の検体を扱う場合は、どのように抽出して検体を準備する（前処理）かが大切です。市販されているPCRキットは、決められた条件の検体ならば、確実に増幅できるように調製されています。
また、PCRには、増えたかどうかだけを調べる「定性PCR」と増えた量を調べる「定量PCR」があります。定量PCRでも標準物質との比較で相対的に定量するqPCRと検体のDNAを限界希釈して絶対定量するデジタルPCRという方法があります。

３．PCRとPCR検査は違うの？

PCRは、体質や遺伝性の病気を調べる遺伝学的検査、がん患者さんの体細胞遺伝子検査、感染症の原因究明のためにウイルスや細菌のDNAやRNAを調べる感染症検査に広く用いられています。PCRは、適切な条件で行えば高い特異性で高感度に特定のDNA断片を検出できます。ここでいう検査の「感度」とは罹患者が陽性と出る確率、「特異度」（特異性ではない）とは非罹患者が陰性となる確率です。さらに罹患率が分かると、検査結果が陽性の時、本当に罹患している陽性的中率（PPV）=真の陽性者/偽陽性者+真の陽性者、検査結果が陰性の陰性的中率（NPV）=真の陰性者/偽陰性者+真の陰性者がわかります（ベイズ統計3）。PCRを用いた検査の「感度」、「特異度」は、検体の採取法、検体の準備（前処理）、PCR増幅、データ解析の全工程によって決まります。PCRの感度や特異性が高く、精度管理しながら熟練した実験者が行っても検査の感度・特異度が高くなるとは限りません（表1）。

図３　PCRによる遺伝子検査
COVID-19のPCR検査の感度、特異度は多くの報告があります4)。感度80％、特異度99％として考えてみましょう。Aは、罹患率（感染率）1％でもし1万人をスクリーニング検査した場合の予測です。感染者での検査陰性、非感染者での検査陽性の人が予想されます。また、Bでは、PPVやNPVは感染率に依存することが分かります。PCRばかりでなく、検体採取、RNA抽出と逆転写などの前処理、ウイルスの濃度や状態など検査には様々な要因が作用します。

４．まとめ

優れた技術にも限界があります。PCRは汎用性のある優れた技術ですが、実験条件を設定しても解析では（実験では最小検出感度や特異性、検査ならば感度、特異度、PPV、NPVなど）で限界があります。これらを理解した上で実験に用い結果を評価することが必要です。

参考文献：
1. 大藤道衛：「バイオ実験超基本Q&A 改訂版」羊土社（2010）
2. 大藤道衛：「バイオ実験トラブル解決超基本Q&A」羊土社（2002）
3. 浅井隆：いまさら誰にも聞けない「医学統計の基礎のキソ」2アトムス（2010）
4. Wang W. et al. JAMA. 323(18):1843-1844 (2020)